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脂质组学分析的主要仪器方法
>2022-12-02 09:00:00



1脂类化合物及脂质组学的研究意义


脂类化合物通常被定义为自然界中存在的一类难溶于水、易溶于有机溶剂的小分子化合物,是生物体内非常重要的物质。作为构成生物膜的主要成分,脂类化合物具有分子多样性和多种生物功能,包括为蛋白质相互作用提供合适的环境、储存能量、作为重要的信使分子等。国际脂质分类和命名委员会(International Lipid Classification and Nomencla-ture Committee)给出的脂质类化合物定义为:全部和部分来自基于负碳离子的硫酯缩合(脂肪酰类、甘油脂类、甘油磷脂类、鞘脂类、糖脂类和聚酮化合物)和/或基于正碳离子的异戊二烯缩合(异戊烯醇类和固醇类)的疏水性或两性小分子[1].这一定义将脂类化合物分为8大类型,每个类型又可根据极性头基的不同分为不同的亚类,每一亚类又可进一步根据碳链的长度和不饱和度细分为不同的分子种属,这就构成了脂类化合物的三级分类系统。脂质代谢通路战略(LIPID MAPS)联合会也采用这一定义[2],目前LIPID MAPS的数据库中包含了4万多个脂类化合物[3].

脂类化合物与细胞凋亡、信号传导、疾病感染、免疫功能,以及胎儿代谢缺陷都密切相关[1],脂类化合物的代谢还与糖尿病[4]、肝癌[5]、肾病[6]、乳腺癌[7]密切相关。随着研究的深入和各种组学的出现,有关学者于2003年提出了脂质组学 (lipido-mics)的概念[8].所谓脂质组学就是对脂质分子种属及其生物功能的全面描述,主要研究与蛋白质表达有关的脂质代谢及其功能[9].因此,脂质组学的研究属于生命科学的范畴,与人类的健康密切相关。目前,脂质组学已成为代谢组学最重要的分支之一,且是一个非常活跃的研究领域,尤其在疾病研究方面的重要性已经引起了科学界的广泛关注[10],论文发表数量逐年增加(见图1)。最近有科研人员研究了肥胖症[11]、动脉粥样硬化[12]、脑脊髓液[13]、代谢综合征[14]和脑癌[15]的脂质组学。植物脂质组学的研究也有报道[16].随着特定的脂类生物标志物的发现和确认以及新的数据处理软件的发展,脂质组学在生物医学研究中已被用于药物活性和治疗效果的评价以及某些疾病的早期诊断[10].

2脂质组学分析的主要仪器方法

脂质组学是典型的交叉学科,图2是其研究工作流程[1].一般分为3步:(1)明确生物医学问题;(2)脂质组学分析,包括取样和样品制备、分离鉴定和数据处理;(3)结果解析,获得脂类化合物相关的图2脂质组学研究工作流程Fig. 2 Workflow of lipidomics research代谢通路,筛选生物标志物。其中非常重要的部分是脂质组学分析,它为最终研究结果提供关键的数据。生物功能解析则要借助于生物信息学、病理学、临床数据和计算机软件等工具来实现。

脂类化合物种类繁多,生物样品基质复杂,故脂质组学分析需要借助先进的分离技术和检测手段。目前主要采用各种色谱技术,包括薄层色谱(TLC)法、气相色谱(GC)法、毛细管电泳(CE)法、超临界流体色谱(SFC)法、高效液相色谱(HPLC)法和各种质谱(MS)技术,以及色谱-质谱联用技术。核磁共振(NMR)、红外光谱和拉曼光谱用得较少,主要原因是这些技术的分离能力有限,对脂类化合物的检测 灵 敏 度 尚 不 能 令 人 满 意,且 定 性 能 力 也 不强[17,18].脂质组学分析主要涉及样品处理、轮廓分析、目标分析、成像分析,以及数据处理。下面主要围绕色谱和质谱技术来讨论脂质组学分析中的仪器和方法。

2.1样品处理(sample preparation)

脂类化合物的分析首先要从复杂的基质中将脂类物质提取出来,以保证后续分析的成功。全脂质化合物的最常用提取方法是Folch等[19]提出的氯仿甲醇提取法。近年来也有改进这一方法的报道[20-22].改进的方法在一定程度上缩短了提取时间,提高了某些脂类化合物的提取效率,但是样品处理通量还是不能令人满意。因此,近年来人们也在研究用固相萃取(SPE)、微波辅助提取(MAE)、超临界流体萃取(SFE)和加压流体萃取(PFE)等技术来处理脂类样品[23],以期借助自动化提高样品处理通量。总之,目前脂类化合物分析中样品处理还是多用传统的液液萃取方法,因为这些萃取方法对大部分脂类化合物有较好的萃取效率。自动化萃取多用仪器方法,虽然萃取时间可以大为缩短,但对不同脂类化合物的普适性还有待提高,这方面仍然需要进一步研究。

2.2轮廓分析(profiling analysis)

轮廓分析或非目标分析(untargeted analysis)也叫全脂分析(global analysis),即对生物样品中所有的脂类化合物及其代谢产物进行分离鉴定,以便从中筛选生物标志物。此种分析主要是色谱-质谱联用方法。早期多用TLC(以及TLC-MS)和GC(以及GC-MS),但前者分离效率低,后者需要对脂类化合物进行衍生化处理,分析步骤复杂而耗时,现已较少使用。而LC-MS则越来越多地用于脂质组学分析,这是因为LC的模式多,适合复杂的脂类化合物的分离,且无需衍生化;加之MS技术发展迅速,各种高分辨MS和串联MS(常使用MS/ MS),以及与LC的接口(主要是电喷雾)的商品化,使得LC-MS具备了卓越的分离和鉴定能力[24].尤其是二维液相色谱(2DLC)技术可获得上万的峰容量,更是成为轮廓分析的首选。在各种2DLC中,正相(NP)LC和反相(RP)LC的联用最具优势,因为NPLC作为第一维可以按照分子的极性(头基)不同将脂质化合物分为大类,第二维的RPLC则依据分子的疏水性(脂肪酸链)不同而分离同一类脂质化合物中不同种属的分子[25].由于NPLC的流动相是有机溶剂,而RPLC则用水相流动相,二者是不互溶的,采用真空蒸发接口[26]连接NPLC和RPLC可以获得较为理想的结果。然而,目前2D(NP / RP)LC-MS / MS采用实验室自行搭建的接口,自动化水平和分析重现性均有待提高,分析时间较长。因此,开发更完善、更有效的2D(NP / RP)LC接口,实现高通量自动分析是一个重要的研究课题。

此外,采用MS直接分析的“鸟枪”脂质组学法(shotgun lipidomics)也用于轮廓分析[27,28],其特点是分析速度快、鉴定能力强,但不足也比较明显:一是仪器价格昂贵,为保证定性准确性,需要用高分辨甚至超高分辨MS;二是脂质成分信息缺失,鸟枪法中全脂未经色谱分离即在离子源电离,导致低丰度和难电离脂质成分的电离受到明显抑制,造成相关脂质无法检出;三是脂质结构信息缺失,异构体在生物体内的作用可能存在明显差异,准确鉴定就显得尤为重要,单独采用MS的鸟枪法很难区分某些脂质异构体(如位置异构和对映异构),而2DLC-MS / MS可以分离并定性定量分析这些异构体[5,25].

2.3目标分析(targeted analysis)

目标分析即针对几种、一类或少数几类脂质化合物(如生物标志物)进行分析。目标分析要求速度快、定性定量准确。直接MS分析和RPLC是常用方法,特别是超高效LC(UHPLC)与MS联用方法分离效率高、分析速度快。对于原位分析或者活体分析,敞开式离子化质谱(AMS)是一种很有潜力的技术。比如,声波辅助喷雾离子化(EASI)-MS可以原位分析活体蓝细菌表面的典型脂类代谢产物[29].作 者[29]选 择 单 细 胞Synechocystis sp.PCC6803、多细胞Anabaena sp. PCC7120和单细胞Synechococcus sp. PCC7002 3种不同的蓝细菌为模型微生物,采用EASI-MS对其表面的脂类化合物进行检测。对所获得的MS数据进行主成分分析(PCA),发现了脂类的含量与蓝细菌生长状态之间的有机联系。在质谱负离子模式下,硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)是响应最强的两种脂类。通过进一步对两种脂类化合物进行目标分析,证明SQDG/ PG的含量比会从蓝细菌生长指数期进入稳定期时急剧升高。这样,就可以用EASI-MS快速表征蓝细菌的生长期。通过基因操纵技术对蓝细菌膜内脂类进行改变,验证了EASI-MS的实验结果可以准确反映蓝细菌膜内脂类的真实含量。此外,为了探究蓝细菌膜内SQDG和PG产生变化的原因,还做了加磷实验。有趣的是,随着蓝细菌年龄的增长,其膜内主要不饱和脂的不饱和度会显着下降[29].然而,AMS用于脂质组学目标分析仍面临一些挑战,包括在敞开式环境下脂类化合物的离子化效率较低,不经LC分离直接用MS分析常常遇到基质干扰问题。如何从仪器的角度出发解决这些问题也是一个重要课题。

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