线 粒 体 超 氧 化 物 歧 化 酶２（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ２）属于金属过氧化物歧化酶家族成员，是真核生物中的主要抗氧化酶，其在胞浆内合成，移至线粒体发挥作用，在清除细胞活性氧化物中起重要作用。有研究显示：过氧化物和辐射等刺激能够诱导ＳＯＤ２基因的表达，且ＳＯＤ２可 以 起 到 对 肿 瘤 细 胞 的 抑 制 作 用。研究表明：
ＳＯＤ２基因在细胞内过表达时能有效保护细胞免受氧化应激的损伤，而ＳＯＤ２基因缺失的小鼠可出现皮肤及免疫系统衰老的征象，提示其在细胞的抗氧化保护中起重要作用。研究发现：
ＳＯＤ２基因在人脐静脉内皮细胞 （ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ＨＵＶＥＣ）中呈弱表达，本研究构建ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２重组质粒，观察ＳＯＤ２基因在ＨＵＶＥＣ中的表达情况，并采用荧光定量ＰＣＲ方法检测其差异性表达，旨在为ＳＯＤ２基因功能研究奠定基础。
１材料与方法
１．１菌株、载体及细胞大肠杆菌 ＤＨ５α购于大连宝 生 物 工 程 有 限 公 司，ｐｃＤＮＡ３．０质 粒 购 于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ＨＵＶＥＣ为吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室保存。
１．２ 主要试剂 Ｐｆｕ高保 真ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ＤＮＡ连 接 酶、ＡＭＶ逆 转 录 酶、Ｔｒｉｚｏｌ试 剂、ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ及ＤＮＡＭａｒｋｅｒλ－ＥｃｏＴ１４购自大连宝生物工程有限公司；ＥｃｏＲⅠ和Ｘｈｏ Ⅰ内切酶购自北京纽英伦生物技术有限公司；凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；质粒提取试剂购自Ｏｘｙｇｅｎ公司；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００购自ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）。
１．３引物设计根据ＮＣＢＩ关于人ＳＯＤ２编码序列设计引物。为了定向克隆的方便，在上游引物和下游引物分别引入了ＥｃｏＲⅠ和Ｘｈｏ Ⅰ酶切位点，引物序列如下：
Ｆｏｒｗａｒｄ，５′－ＡＣＧＴＡＣＣＧＧＴＡＴ－ＧＴＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＣＧ－３′；Ｒｅｖｅｒｓｅ，５′－ＡＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＣＡＴＧＴ－ＡＴＣＴＴＴＣ－３′；隆片段为６８１ｂｐ。引物由上海生物工程公司合成。
１．４细胞培养ＨＵＶＥＣ用含１０ ％胎牛血清的ＩＭＤＭ培养基置于３７℃孵育箱中培养。
１．５细胞总 ＲＮＡ 提取应用Ｔｒｉｚｏｌ试剂按厂家说明书提取细胞总ＲＮＡ；用酶标仪于２６０和２８０ｎｍ波 长 处 测 定 吸 光 度 （Ａ）值，分 别 根 据Ａ２６０值及Ａ２６０／Ａ２８０比值确定ＲＮＡ浓度和纯度，根据凝胶电泳确定ＲＮＡ样品的完整性。
１．６逆转录 （ＲＴ）反应应用逆转录试剂盒按厂家说明书进行ＲＴ反应，合成第一股ｃＤＮＡ。
１．７ＰＣＲ 扩增获取人 ＳＯＤ２ 编码区应用ＰｆｕＤＮＡ聚合酶反应体系按厂家说明书对上述获得的ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。扩增程序为：９４ ℃预变性２ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，６２℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ结束后每管取５μＬ加入６×ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ１μＬ，混匀，上样，１．５％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物。用紫外凝胶成像仪对ＰＣＲ产物电泳条带进行扫描照相。
１．８ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２重组质粒的构建按照凝胶回收试剂盒说明书，对ＲＴ－ＰＣＲ产物电泳的目的条带进行回收。回收的ＳＯＤ２片段与ｐｃＤＮＡ３．０真核表达载体一起用ＥｃｏＲ Ⅰ和ＸｈｏⅠ双酶切，Ｔ４连接酶连接，克隆至ｐｃＤＮＡ３．０载体中。连接体系如下：
１μＬＲＴ－ＰＣＲ产物，１μＬｐｃＤＮＡ３．０质粒，ｄｄＨ２Ｏ１９．５μＬ，混匀。４５℃、５ ｍｉｎ，冰上１ｍｉｎ，加入２．５μＬＤＮＡＬｉｇａｓｅＢｕｆｆｅｒ、１μＬＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ后，１６℃过夜连接。取１００μＬＤＨ５α感受态细胞，加入５μＬ连接产物，混匀后冰浴３０ｍｉｎ，４２℃热击９０ｓ，冰浴２ｍｉｎ，加入９００μＬＬＢ培养基，３７℃温和振荡复苏细胞１ｈ，取１００μＬ转化产物涂布于含氨苄霉素的ＬＢ平板上，３７℃孵箱倒置培养２０ｈ，观察菌落生长情况。
１．９菌落ＰＣＲ 鉴定重组阳性克隆２５μＬ反应体系中 加 入ＰｆｕＴａｑＤＮＡ聚 合 酶ＭＩＸ混 合 物１２．５μＬ，上、下游引物各１μＬ，加灭菌双蒸水至２５μＬ，用灭菌牙签挑取单个圆滑菌落少许点入反应体系中。ＰＣＲ反应条件：９４ ℃预变性２ ｍｉｎ；９４℃变 性３０ｓ，６２ ℃退 火３０ｓ，７２ ℃延 伸１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ结束后每管取５μＬ加入６×ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ１μＬ，混匀，上样，１．５％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物。用紫外凝胶成像仪对ＰＣＲ产物电泳条带进行扫描照相。
１．１０ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２质粒双酶切质粒提取：
取ＰＣＲ鉴定含有重组质粒的单一克隆，接种到含５０ｍｇ·Ｌ－１氨苄霉素的ＬＢ液体培养基中，３７℃、２２０ｒ·ｍｉｎ－１培养过夜。按照Ａｘｙｇｅｎ质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取。将提取的ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２质粒进行ＥｃｏＲ Ⅰ和ＸｈｏⅠ双酶切反应，取５μＬ酶切产物进行１％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察照相。
１．１１ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２序 列 测 定测 序 物 为ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２重 组 质 粒， 引 物 为 通 用 引 物ＰＣＤＮＡＴ７，测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中的ＳＯＤ２序列进行对比。
１．１２ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２重组质粒转染 ＨＵＶＥＣ按照Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００试 剂 转 染 说 明 书 进 行２４孔板贴壁细胞的转染。转染后６ｈ换ＩＭＤＭ培养液，细胞继续培养。
１．１３ＲＴ－ＰＣＲ 检测转染后 ＨＵＶＥＣ 中 ＳＯＤ２基因表达提取细胞总ＲＮＡ，进行ＲＴ－ＰＣＲ反应。ＰＣＲ产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳，照相分析。
２结果
２．１ＳＯＤ２编码区 ＤＮＡ 片段的扩增从ＨＵＶＥＣ提取的总ＲＮＡ经鉴定其纯度和完整性均 较好，ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物凝胶电泳得到约６８１ｂｐ的ＤＮＡ条带，即基因ＳＯＤ２编码序列ＣＤＳ（６６９ｂｐ）加上两端酶切位点的片段长度，与预期扩增片段大小相符 （图１）。
２．２ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２表达载体的筛选应用对菌落的直接ＰＣＲ扩增法筛选阳性克隆，以菌落上的少许菌体直接作为模板进行ＰＣＲ扩增，经电泳分析发现：选取的５个菌落可见到６８１ｂｐ大小的阳性条带 （图２），与预期片段大小一致，推测此克隆即为含有ＳＯＤ２基因插入片段的阳性克隆。
２．３重组质粒ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２的双酶切鉴定选取阳性克隆提取质粒ＤＮＡ，并进行ＥｃｏＲⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切鉴定，结果见到６８１ｂｐ的条带和载体片段 （图３），此克隆为插入有ＳＯＤ２基因的重组质粒。
２．４表达载体的最终鉴定将构建的表达载体送上海英骏生物技术有限公司进行测序分析，测序的部分图谱见图４，结果表明测序反应完全可靠。ＤＮＡ测序结果见图５，表达载体包含ＳＯＤ２全长编 码 区 的６６９核 苷 酸 序 列， 与ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＭ－０００６３６）报道结果完全一致。
２．５转染重组质粒的 ＨＵＶＥＣ中ＳＯＤ２的表达将重 组 质 粒ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２转 染ＨＵＶＥＣ后，在３７℃、５％ ＣＯ２条件下培养２４ｈ，加入Ｇ４１８筛选 有 抗 性 的 克 隆 细 胞。 收 获 转 染 重 组 质 粒ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２的ＨＵＶＥＣ和空载对照组细胞，提取总ＲＮＡ，经过反转录得到ｃＤＮＡ，然后以其为模板进行ＰＣＲ扩增，电泳分析结果表明：与呈弱阳性条带的对照组比较，转染组细胞的目的条带清晰可见。见图６。
ＳＯＤ是机体内重要的抗氧化酶之一，能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢。
在人和哺乳动物中，ＳＯＤ分为：
ＦｅＳＯＤ（ＳＯＤ１），存在于细胞内质网；ＭｎＳＯＤ（ＳＯＤ２），位于线粒体 中 ；ＣｕＺｎＳＯＤ（ＳＯＤ３），为 细 胞 外 基 质 超 氧 化物酶。ＳＯＤ２编码的锰超氧化物歧化酶可以与氧化磷酸化作用的超氧化物副产物结合，从而将线粒体中产生的超氧离子清除，产生氧化能力相对较弱的过氧化氢。
ＨＵＶＥＣ是较易受到氧化损伤的一类细胞，在环境及药物的持续刺激下，该细胞会呈现一定的 氧 化 损 伤 继 而 发 生 凋 亡。本 研 究 发 现：
ＳＯＤ２在ＨＵＶＥＣ中 呈 弱 表 达。 超 氧 阴 离 子（Ｏ２－）、过氧化氢等活性氧能引发多种病理效应，导致 癌 症、 过 敏、 动 脉 硬 化 和 老 年 痴 呆 等 疾病。 研 究发 现： 过 氧 化 物 和 超 氧 化 物（ＲＯＳ）等能够诱导ＳＯＤ２基因的转录，从而使低浓度的活性氧自动被机体清除。当机体暴露于高水平的活性氧环境中时，由于线粒体中的ＤＮＡ无组蛋白的保护和有效的ＤＮＡ修复系统，因此很容易引起氧化损伤，并最终导致癌症的发生。鉴于环境中辐射、氧化及生物体衰老等氧化应激反应的不可避免性，且机体正常情况下ＳＯＤ２表达相对ＳＯＤ１较低，在人体正常细胞，尤其易受到氧化损伤的内皮细胞过表达ＳＯＤ２便显得尤为重要。对于ＳＯＤ基因的研究已经用于防辐射、防缺血再灌注、抗自身免疫性疾病、抑制肿瘤和癌症等方面。
对于ＳＯＤ２基因研究的生物学效应也很广泛，但ＳＯＤ２基因在抗氧化及抗肿瘤中的具体作用途径及机制尚有待进一步探讨。随着人们对氧化应激机制研究的不断探索，ＳＯＤ２基因也日益广泛地受到关注。本实验克隆了ＳＯＤ２ＤＮＡ编码区序列，构建了ｐｃＤＮＡ３．０－ＳＯＤ２真核表达载体，并能在真核细胞中过表达，本研究结果为进一步的体内研究及基因治疗创造了条件，为研究ＳＯＤ２在氧化应激相关疾病发生发展中的作用奠定了基础。
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