细胞间隙连接\\(GJ\\)是细胞间直接进行物质交流的唯一膜通道结构[1].它由相邻细胞膜上间隙连接蛋白\\(Cx\\)形成的半通道\\(连接子\\)对接而成,目前所鉴定出的20多种Cx中,以Cx43表达最广泛.研究发现,在肿瘤和转化细胞中,普遍存在Cx43表达异常、细胞间隙通信\\(GJIC\\)功能缺陷,这与Cx43合成、运输、定位等过程多种相关蛋白有关[17~20].本文就细胞骨架蛋白、非受体酪氨酸蛋白激酶Src、细胞支架蛋白\\(ZO-1\\)及泛素蛋白成员CIP75等相关蛋白与Cx43相互作用,及其对细胞间连接通信的影响作一综述.

1 、Cx43与细胞骨架蛋白

由微丝、微管和中间丝形成的细胞网络骨架结构,在维持细胞形态结构等多种生命活动中发挥着重要功能.通过GST分析与免疫共定位法,发现Cx43通过C末端直接与细胞骨架微管蛋白\\(MT\\)相互作用[1-2],Cx43的C末端近膜区域35个氨基酸与MT结合后,细胞间Cx43斑点发生改变,但并未影响GJIC功能[2].用秋水仙碱破坏MT后,与Cx43的作用受抑制,明显提高了Cx43周转[3].细胞的另一骨架蛋白\\(肌动蛋白丝\\(F-actin\\)\\)也参与Cx43调控.研究发现,通过细胞松弛素阻断F-actin组装后对GJ形成的影响并不明显[4],这是由于F-actin主要是通过大脑发育条调蛋白Drebrin来调控的Cx43的[5].Drebrin作为肌动蛋白的结合蛋白,在细胞受到胞外信号诱导时,它可通过与细胞质膜上Cx43的C末端相互作用,促使其定位于细胞膜上形成GJIC.有实验以siRNA 敲除Drebrin后,发现Cx43表达下调,原GJ斑发生内在化,造成相邻细胞间的连接受损[5].

2 、Cx43与ZO-1ZO-1

是膜相关鸟苷酸激酶成员之一,在各种上皮细胞中均表达,分子质量225 ku,其N末端含PDZl~3、1个GUK和1个SH3结构域,而C 末端含α基序和1个富含脯氨酸的末端[6].其中,与天然结构蛋白Connexin家族结合的主要是PDZ 结构域[7].研究发现,ZO-1在接触细胞附近呈散点分布,能与该处的Cx43结合,且能随Cx43内在化进入细胞内部最终由溶解酶降解[8].ZO-1在起始GJ形成及维持其稳定过程中发挥重要功能,通过sRNAi敲除ZO-1或阻断ZO-1与Cx43结合后,Cx43在细胞膜上的表达下调,且形成不具功能的GJ斑,最终下调GJIC[9-10].虽然ZO-1与Cx43相互作用对形成GJ的调控机制尚不清楚,但在某些细胞中发现,ZO-1通过介导Cx43与F-actin相互作用直接或间接起始GJ的形成[4].ZO-1通过第2个PDZ 区域直接与Cx43的C末端19个氨基酸残基相互作用,在细胞膜表面与Cx43结合,介导形成GJ斑[11].通过将与ZO-1结合的Cx43 C末端缺失,或将与Cx43结合的PDZ进行位点突变后,ZO-1仍能与Cx43相互作用,并最终形成功能性GJIC[12].有发现,下调ZO-1水平后GJ斑增加,而该过程并非因Cx43表达水平改变引起[13],这表明ZO-1不仅仅通过第二个PDZ功能域影响GJIC.此外,ZO-1还能作为桥梁连接肌动蛋白丝F-actin与Cx43在形成与维持稳定的GJ中发挥重要功能[4].因此,ZO-1主要通过锚定细胞骨架、参与Cx43内在化、调控Cx43在膜上的斑点等形式维持GJ的稳定性[14],进而发挥其在GJIC形成等过程中的功能.

3 、Cx与Src

Src是由原癌基因src编码的具有酪氨酸激酶活性的蛋白,主要以病毒癌基因表达蛋白v-Src和细胞癌基因表达蛋白c-Src两种形式存在.分子量60 ku,其结构从氨基端到羧基端依次为SH3、SH2结构域\\(参与大分子直接作用以及传递信号\\)、1个PTK功能域、1个保守的由70个氨基酸组成的C末端[14].研究发现,在多种肿瘤细胞中Src过表达.Src主要通过刺激信号通路,传输存活和增殖信号改变细胞骨架网络,影响细胞粘附、迁移和入侵诱发肿瘤转化.机体细胞内,多种受体蛋白家族活化Src后通过多种机制影响Cx43表达[16].Src能直接磷酸化Cx43:Src的SH3区域与Cx43富含脯氨酸区域结合后,使Cx43的Tyr265位点磷酸化,此后与Src SH2区域结合,磷酸化Cx43的Tyr247位点,从而阻断GJIC[15].研究发现,磷酸化Tyr247或者Tyr265不足以关闭Cx43通道[17],这可能是由于Src磷酸化Try265、Try247后,Cx43构象发生改变,也许该过程影响Cx43与SH2区域的蛋白结合,从而影响通道开启.研究表明,Src通过募集有丝分裂原激活蛋白激酶促使Cx43Ser残基磷酸化,继而阻断GJIC.

Src能通过活化磷脂酶C后激活PKC也能直接磷酸化PKC后,进而使Cx43的S368和S372位点发生磷酸化[19],影响GJIC的功能,导致肿瘤发生.Src活化后能作为效应因子调控多个信号途径间接磷酸化Cx43Ser位点,下调GJIC.Src也能联合其他酶类如PKA等调控GJIC[20].配体蛋白Cas也能被Src利用后与Cx43相互作用抑制GJIC形成[21].在治疗肿瘤过程中,主要通过增强Cx43表达或者抑制Src,有效降低Src对GJIC的影响.

4 、Cx43与泛素蛋白

CIP75CIP75是一种新的含有泛素样结构域\\(UbL-UBA\\)蛋白家族成员,分子质量75 ku,最初定位于内质网附近.CIP75 C末端含UBA结构域,而UbL位于N-末端.泛素蛋白参与蛋白酶体途径主要是通过UBA与靶蛋白的氨基团或靶蛋白的Cys、Ser和Thr等残基相连,靶蛋白被泛素化修饰后,经蛋白酶体途径而降解[22].研究表明,蛋白酶体与Cx43的下调有关,Cx43泛素化也与 Cx43的周转以及稳定性密切相关[23].CIP75主要通过UBA区域与Cx43富含脯氨酸的C末端结合,使内质网Cx43转移到细胞质中,然后CIP75 的UbL与胞质19 S蛋白酶体亚基结合,启动蛋白酶体途径从而下调Cx43的表达[23].此外,细胞内CIP75过表达及其转录后的修饰均能显著影响Cx43合成.因此,CIP75通过下调细胞质中Cx43表达水平,进而影响细胞间隙连接通讯功能.Cx43相关蛋白细胞骨架蛋白,ZO-1与Cx43直接相互作用影响Cx43在细胞膜上的锚定和定位;Src通过多种途径磷酸化Cx43最终抑制GJIC功能;CIP75促使Cx43表达下调,影响细胞的间隙连接通讯.因此,深入研究Cx43与相关蛋白的作用,对探索细胞的生命活动及细胞异常病变有重要意义.

参考文献:

[1] JONGSMA H J,WILDERS R. Gap junctions in cardio-vascular disease[J]. Circulation Research,2000,86\\(12\\):1193-1197.

[2] GIEPMANS B N G,VERLAAN I,HENGEVELD T,et al.Gap junction protein connexin-43 interacts directly withmicrotubules[J]. Current Biology,2001,11\\(17\\):1364-1368.

[3] WATERMAN S C M,SALMON W C,SALMOM E D,etal. Feedback interactions between cell-cell adherens junctionsand cytoskeletal dynamics in newt lung epithelial cells[J].Molecular Biology of the Cell,2000,11\\(7\\):2471-2483.

[4] CHAKRABORTY S,MITRA S,FALK M M,et al.E-cadherin differentially regulates the assembly ofconnexin43 and connexin32 into gap junctions in humansquamous carcinoma cells[J]. Journal of BiologicalChemistry,2010,285\\(14\\):10761-10776.

[5] BUTKEVICH E,H?LSMANN S,WENZEL D,et al.Drebrin is a novel connexin-43 binding partner that links gapjunctions to the submembrane cytoskeleton[J]. CurrentBiology,2004,14\\(8\\):650-658.

[6] HUNTER A W,BARKER R J,ZHU C,et al. Zonulaoccludens-1 alters connexin43 gap junction size andorganization by influencing channel accretion[J]. MolecularBiology of the Cell,2005,16\\(12\\):5686-5698.

[7] LAING J G,MANLEY M R N,KOVAL M,et al.Connexin45 interacts with zonula occludens-1 andconnexin43 in osteoblastic cells[J]. Journal of BiologicalChemistry,2001,276\\(25\\),23051-23055.

[8] GILLERON J,CARETTE D,FIORINI C,et al. Connexin43 gap junction plaque endocytosis implies molecularremodelling of ZO-1 and c-Src partners[J]. Communicative& Integrative Biology,2009,2\\(2\\):104-106.

[9] HUNTER A W,JOURDAN J,GOURDIE R. Fusion of GFPto the carboxyl terminus of Connexin43 increases gapjunction size in HeLa cells[J].Cell Commun Adhes,2003,10,211-214.

[10] LAING J G,CHOU B C,STEINBERG T H. ZO-1 alters theplasma membrane localization and function of Cx43 inosteoblastic cells[J]. Journal of Cell Science , 2005 .