骨髓增生异常综合征（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｓｙｍ\ue011ｄｒｏｍｅ，ＭＤＳ）是一种起源于造血干细胞异常克隆的血液系统疾病，主要表现为外周血一系或多系血细胞减少，骨髓活检可见特征性的幼稚前体细胞异常定位病理结构。ＤＮＡ甲基化转移酶抑制剂（ＤＮＡＭｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＤＮＭＴＩ）的出现为ＭＤＳ患者提供了新的治疗策略。
ＤＮＡ甲基化转移酶 １ａ（ＤＮＡＭｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１ａ，ＤＮＭＴ１ａ）是一种维持 ＤＮＡ甲基化状态的酶，ＤＮＡ在复制时 ＤＮＭＴ１ａ可以甲基化修饰新合成的子链 ＤＮＡ，使 ＤＮＡ维持亲本的甲基化状态。地西他滨（Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ，ＤＡＣ）作为一种 ＤＮＭＴＩ可通过降解 ＤＮＭＴ１ａ，降 低 基 因 组 ＤＮＡ５′ｍＣ 水 平。
Ｓｈｏｃｋ等报道了 ＤＮＭＴ１ａ可以通过 Ｎ端的一段信号肽序列定位于线粒体中，与线粒体 ＤＮＡ结合。线粒体 ＤＮＡ编码的蛋白参与线粒体氧化呼吸链的电子传递过程，线粒体氧化呼吸复合体功能的异常可以导致线粒体功能的改变。目前国内外有关ＤＡＣ是否可以通过影响线粒体基因组编码蛋白的表达，从而改变细胞的功能与状态的研究较少。本研究的目的在于探讨 ＤＡＣ是否存在除基因组整合以外影响线粒体功能的作用。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１细胞系ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞受赠于上海交通大学第六人民医院李晓教授。
１．１．２主要试剂与仪器细胞培养用 １６４０培养基、胎牛血清分别购于美国 Ｇｉｂｃｏ和 Ｈｙｃｌｏｎｅ公司。
ＰＩ、Ｂｒｄｕ、鼠源 ａｎｔｉ\ue011Ｂｒｄｕ抗体、兔抗鼠二抗\ue011ＦＩＴＣ、阿非迪霉素购于美国 Ｓｉｇｍａ\ue011Ａｌｄｒｉｃｈ公司。细胞总ＲＮＡ提取用 Ｔｒｉｚｏｌ购于美国 Ｌｉｆｅｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ公司，反转录试剂盒 ｇＥｒａｓｅｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ为日本 Ｔａｋａｒａ公司产。ｑＲＴ\ue011ＰＣＲ所用 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ购于日本ＴＯＹＯＢＯ公司，实时定量 ＰＣＲ仪 Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅ４８０为瑞士 Ｒｏｃｈｅ公司产。ＲＯＳ检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。
１．２方法
１．２．１细胞培养及细胞周期同步化ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞系在 ３７℃、５％ＣＯ２条件下培养于含有１００Ｕ／ｍＬ青霉素、１００μｇ／ｍＬ链霉素、１０％胎牛血清 １６４０培养基中，间隔２～３ｄ添加１次白介素\ue011３（ＩＬ\ue011３）（ｖ∶ｖ＝１∶１０００），每隔４～５ｄ传代１次。ＡＰＣ以浓度２ｍｇ／ｍＬ溶解于 ＤＭＳＯ中并保存于 －８０℃超低温冰箱。将ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞以 ５×１０５个／ｍＬ接种在 ２４孔板中，实验组 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞添加 ＡＰＣ至浓度为２０μｇ／ｍＬ，对照组 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞添加 ＤＭＳＯ，３７℃、５％ＣＯ２条件下培养 ２４ｈ同步化 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞。
１．２．２采用 Ｂｒｄｕ渗入试验检测细胞周期同步化实验组（ＡＰＣ同步化）细胞与阴性对照组（ＤＭＳＯ）细胞，加入终浓度为１５μｇ／ｍＬ的 Ｂｒｄｕ（溴化脱氧尿嘧啶），细胞培养箱中孵育３ｈ，４℃条件下７０％乙醇固定８ｈ，将固定后的细胞置于 ２ｍｏｌ／ＬＨＣＬ处理３０ｍｉｎ。加抗 Ｂｒｄｕ抗体室温孵育 １ｈ。用 ＦＩＴＣ标记的兔抗鼠二抗室温孵育 ３０ｍｉｎ，重悬于含有 ＰＩ的 ＰＢＳ中，流式细胞仪 ＦＬ１、ＦＬ３通道检测 Ｂｒｄｕ的渗入量。
１．２．３ＤＣＦＨ\ue011ＤＡ检测 ＲＯＳ的产生将 ＡＰＣ同步化后的 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞分别与不同浓度的 ＤＡＣ作用２４ｈ，实验组 ＤＡＣ浓度为 １．５、５、１０、１５μｍｏｌ／Ｌ，对照组为无 ＤＡＣ的 ＰＢＳ，ＲＰＭＩ１６４０洗涤细胞 ２次，将细胞重悬于 １０ｍｍｏｌ／ＬＤＣＦＨ\ue011ＤＡ无胎牛血清１６４０中，细胞培养箱中孵育 ２０ｍｉｎ，用 ４℃预冷的Ｈａｎｋ’ｓ缓冲液清洗 ３次，最后用 ４００μＬＨａｎｋ’ｓ缓冲液重悬，采用流式细胞仪 ＦＬ１检测。
１．２．４ｑＲＴ\ue011ＰＣＲ法检测线粒体 ＤＮＡ拷贝数及ＮＤ１、ＮＤ６ｍＲＮＡ转录变化将同步化的 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞与不同浓度 ＤＡＣ（０、１．５、５、１０、１５μｍｏｌ／Ｌ）作用 ２４ｈ，实验组 ＤＡＣ浓度为１．５、５、１０、１５μｍｏｌ／Ｌ，对照组为无 ＤＡＣ的 ＰＢＳ。采用 Ｔｒｉｚｏｌ法提取细胞总 ＲＮＡ，使用 ｇＥｒａｓｅｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔａｋａｒａ）试剂盒将总 ｍＲＮＡ逆转率成 ｃＤＮＡ，以 β\ue011ａｃｔｉｎ为内参行相对定量 ＰＣＲ方法检测 ＮＤ１、ＮＤ６基因表达。
采用 ＴｉａｎｇｅｎＤＮＡ提取试剂盒提取 １×１０６细胞全基因组 ＤＮＡ，检测 ｍｔＤＮＡ的相对拷贝数变化，ＨＢＧ为内参基因。以下为 ｑＲＴ\ue011ＰＣＲ所需的引物序列：ＮＤ１：上游：ＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＡＧＣＣＣＡＡＡＣＡＡＴ\ue011ＣＴ，下 游：ＴＴＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＡ；ＮＤ６：上游：ＴＧＴＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＴＣ，下游：ＧＡＣＡＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＡＡＡＴ，β\ue011Ａｃｔｉｎ：上游：ＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴＴ，下 游：ＡＧＧＡＣＴＣ\ue011ＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡ；ＭｔＤＮＡ：上游：ＣＡＣＣＣＡＡＧＡ\ue011ＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴ，下 游：ＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＴＡＴＧＴＴ\ue011ＧＴＴＡ；ＨＢＧ：上 游：ＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴ\ue011ＴＣＡＣＴＡＧＣ，下游：ＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣ\ue011ＡＣＣ，总反应体系为 ２０μＬ，ＰＣＲ反应条件为：９５℃３０ｓ，９５℃ ３０ｓ，不同引物退火温度设定如下：ＮＤ１、ＮＤ６、β\ue011Ａｃｔｉｎ：５９℃ ，ＭｔＤＮＡ、ＨＢＧ：６０℃，７２℃延伸 ３０ｓ，共 ３８个循环。上述引物扩增片段长度为：ＮＤ１：１４８ｂｐ，ＮＤ６：９１ｂｐ，β\ue011Ａｃｔｉｎ：１３７ｂｐ，ＭｔＤＮＡ：１０８ｂｐ，ＨＢＧ：１２０ｂｐ。根据各基因检测所得 Ｃｔ值，采用 ２－△△Ｃｔ法计算相对基因表达量。
１．３统计学处理所得数据采用 ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ５．０统计软件分析。多样本均数比较采用单因素方差分析，实验组与对照组比较采用 Ｄｕｎｎｅｔｔ\ue011ｔ检验，计量资料以 ｘ珋±ｓ表示。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２结果
２．１ＡＰＣ同步化 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞检测ＡＰＣ将细胞同步化在 Ｇ０／Ｇ１期，细胞无法进入 Ｓ期。由图 １可见，实验组经 ＡＰＣ处理后细胞周期 Ｓ期几乎无细胞存在，而未加 ＡＰＣ处理的对照组 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞按照正常的细胞周期进程，Ｓ期可见有大量细胞存在。
２．２不同浓度 ＤＡＣ对同步化 Ｇ０／Ｇ１期细胞 ＲＯＳ产生的影响见图 ２。由图 ２可见，实验组 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞在５μｍｏｌ／ＬＤＡＣ作用２４ｈ后可以促进同步化的 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞产生 ＲＯＳ，与对照组相比差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。当 ＤＡＣ浓度为 １５μｍｏｌ／Ｌ时细胞内 ＲＯＳ产生较对照组明显较少（Ｐ＜０．０５）。
２．３不同浓度 ＤＡＣ对同步化 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞线粒体ＤＮＡ拷贝数及线粒体编码基因 ＮＤ１、ＮＤ６转录的影响与对照组相比，同步化 ＭＤＳ\ue011Ｌ在低浓度ＤＡＣ（１．５、５μｍｏｌ／Ｌ）条件下可促进线粒体 ＤＮA（ＭｉｔｏｃｈｏｎｄｉａｌＤＮＡ，ＭｔＤＮＡ）拷贝 数 增 加 （Ｐ＜０．０５），但随着 ＤＡＣ浓度增加，ＤＡＣ对 ｍｔＤＮＡ拷贝数影响不大，见图３Ａ。在高浓度 ＤＡＣ（１５μｍｏｌ／Ｌ）作用下，同步化 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞 ＮＤ１、ＮＤ６基因转录明显增加，而低浓度 ＤＡＣ对 ＮＤ１、ＮＤ６的转录影响不大，见图 ３Ｂ、Ｃ。
３讨论
有研究表明，遗传异常在肿瘤发生发展中参与重要的作用。ＤＮＡ去甲基化药物的出现给 ＭＤＳ治疗提供了新的策略。地西他滨（ＤＡＣ）作为美国ＦＤＡ批准的两种用于临床的 ＤＮＡ去甲基化药物之一表现出较好的应用前景，部分 ＭＤＳ患者从中受益。目前有研究认为，ＤＡＣ发挥抗肿瘤作用具有浓度依赖性，在低浓度下 ＤＡＣ主要发挥 ＤＮＡ去甲基化作用，使发生甲基化沉默的抑癌基因重新表达，而高浓度 ＤＡＣ则通过基因组 ＤＮＡ整合发挥细胞毒作用。
线粒体是一种存在于胞浆内的细胞器，参与多种生物学过程如能量代谢、自由基产生、钙离子平衡、蛋白质转录后修饰、细胞凋亡等。线粒体ＤＮＡ拷贝数增减或缺失以及线粒体编码基因的突变可见于多种肿瘤组织中，并与肿瘤的发生进展及预后有关。ＭＤＳ是一种多发于老年患者的血液系统疾病，通过对 ＭＤＳ患者的线粒体 ＤＮＡ测序研究表明，高龄 ＭＤＳ患者线粒体 ＤＮＡ突变频率增加，且突变多发生于非编码区域。此外线粒体ＤＮＡ编码蛋白的表达量以及线粒体 ＤＮＡ的拷贝数增加异常也可见于 ＭＤＳ患者。
本实验通过体外干预，使 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞同步化在 Ｇ０／Ｇ１期，抑制 ＤＡＣ的 ＤＮＡ整合作用，以此探讨 ＤＡＣ是否有对细胞发挥非基因组整合依赖的作用。ＡＰＣ是一种 ＤＮＡ聚合酶抑制，可以特异性结合 ＤＮＡ聚合酶，抑制 ＤＮＡ复制合成从而将细胞周期同步化在 Ｇ０／Ｇ１期。本实验结果显示，ＡＰＣ可以很有效地将细胞同步化在 Ｇ０／Ｇ１期。当同步化的 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞给予不同浓度 ＤＡＣ作用后发现，在低浓度（１．５、５μｍｏｌ／Ｌ）下 ＤＡＣ可促进同步化细胞ＲＯＳ产生，但随着浓度的增加，同步化细胞产生的ＲＯＳ却低于对照组。线粒体内氧化呼吸电子传递是细胞内 ＲＯＳ主要来源。推测可能与 ＤＡＣ改变线粒体功能有关。通过检测不同浓度 ＤＡＣ对同步化 Ｇ０／Ｇ１细胞线粒体 ＤＮＡ拷贝数以及线粒体基因 ＮＤ１、ＮＤ６（ＮＡＤＨｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ１、６）表达的影响。本实验结果显示，低浓度 ＤＡＣ（１．５、５μｍｏｌ／Ｌ）可以促进线粒体 ＤＮＡ拷贝数增加，而高浓度 ＤＡＣ却无此作用。线粒体 ＤＮＡ复制具有半自主性，且受 ＤＮＡ聚合酶 γ催化亚基（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅγｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔＡ，ｐｏｌｇＡ）调控，ｐｏｌｇＡ基因的甲基化程度与线粒体 ＤＮＡ拷贝数呈负相关。此外，有研究发现，在纤维原细胞在受到内源性或外源性氧化物质刺激后，均可刺激线粒体ＤＮＡ拷贝数增加。本实验结果显示，当 ＤＡＣ浓度为 ５μｍｏｌ／Ｌ时，能最大程度促进细胞内 ＲＯＳ产生，而此浓度对线粒体 ＤＮＡ拷贝数影响并非最明显。由此可见，低浓度 ＤＡＣ引起的线粒体 ＤＮＡ拷贝数增加可能与 ＤＡＣ去甲基化作用有关。随着浓度增加，ＤＡＣ引起线粒体 ＤＮＡ损伤，使线粒体ＤＮＡ拷贝数减少，抵消了 ＤＡＣ去甲基化作用所致的线粒体 ＤＮＡ拷贝数增加的作用。因此，在高浓度 ＤＡＣ作用，同步化 ＭＤＳ\ue011Ｌ细胞线粒体 ＤＮＡ拷贝数未见明显改变。虽有研究报道，ＡＰＣ对线粒体功能有影响，但本实验结果显示，ＡＰＣ处理组与ＤＭＳＯ对照组相比，线粒体 ＤＮＡ拷贝数无明显的变化。ＮＤ１、ＮＤ６是已报道的两个线粒体 ＤＮＡ甲基化转移酶参与调控的线粒体基因。低浓度 ＤＡＣ对线粒体的 ＮＤ１、ＮＤ６表达无明显影响，相比之下，高浓度 ＤＡＣ可以促进两者的表达。因氧化呼吸复合体在线粒体内装配异常可影响氧化呼吸链电子传递，所以高浓度 ＤＡＣ通过改变线粒体基因 ＮＤ１、ＮＤ６蛋白表达、氧化呼吸复合物装配异常，从而影响线粒体氧化呼吸电子传递，与对照相比，降低ＲＯＳ的产生。
综上所述，本研究初步探讨了 ＤＡＣ存在细胞毒以外的其他作用，不同浓度 ＤＡＣ可以影响线粒体 ＲＯＳ的产生，改变线粒体 ＤＮＡ拷贝数及调节线粒体基因表达等作用，为深入研究 ＤＡＣ的作用机理提供理念依据。
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