咯菌腈\\(Fludioxonil\\) 是一种新型的非内吸性苯基吡咯类杀菌剂,为假单胞菌属的不同种产生的次生代谢物硝吡咯菌素的类似物\\(杨玉柱,2007\\).对子囊菌、担子菌、半知菌等病原菌引起的病害有非常好的防治效果\\(张晓光,2013\\),且比天然产物硝吡咯菌素抗光解,能专一性地抑制霉菌而广泛地应用于防治农业生产中的真菌性病害 \\( 杨玉柱,2007\\).成为全球销量最好的种子处理剂之一,被大量的在农业生产中使用.而咯菌腈的施用可能通过渗透、迁移等途径进入到土壤和水体中,对土壤和水环境污染可能造成污染.目前对咯菌腈的生物毒性研究少见报道.本文以水生生物溞、藻和陆生生物蚯蚓对其毒性进行研究,以评价其可能对环境造成的潜在风险.
1 材料与方法
1. 1 试验生物
大型溞:为纯品系生物株,引自上海水产大学.在实验室使用纯种小球藻饲喂自培养繁殖,选择溞龄 6 ~24 h、孤雌生殖的雌性幼溞进行毒性试验,试验过程中不喂食.
羊角月牙藻:购自中科院水生生物所种质资源库,藻种采用《农药环境安全评价试验准则》中推荐的 L9 培养液进行培养.
蚯蚓:赤子爱胜,购自天津市东丽区成功蚯蚓养殖场.蚯蚓在试验前于试验环境下培养 7 天,以紫花苜蓿颗粒作为蚯蚓的食物,选择体重为 300 ~600 mg 的健康蚯蚓供试验用.
1. 2 试验介质
溞试验介质为标准稀释水,硬度 250 ±25 mg/L\\(以 CaCO3计\\),pH 值 6 ~ 9,溶解氧浓度在 7 mg/L以上.藻试验介质为 L9 培养液,pH 值为 8. 0 ±0. 1.
蚯蚓试验介质为人工土壤,由草炭、高岭土、石英砂混合后置于 105 ℃条件下烘干,添加去离子水使其含水量控制在干重的 35 %左右 ,混合均匀.
1. 3 供试品
咯菌腈\\(原药\\):纯度 >98 %.
2 试验方法
2. 1 大型溞急性毒性试验
2. 1. 1 试验条件
试验光照强度为 1 000-1 500 LUX,光暗比为16∶ 8,试验水水温为 20 ±1 ℃.
2. 1. 2 试验操作
试验按等间距设置 5 个试验组和一个空白对照组进行,试验配制 0. 2、0. 3、0. 45、0. 68、1. 0 mg/L 的浓度系列,然后将其分装到 100 ml 的烧杯中,每个烧杯装 50 ml 的试验液,每组设置四个平行,每只烧杯随机挑取 5 只大型溞放入试验液中进行试验,大型溞为溞龄小于 24 h 的非头胎幼溞,在烧杯上面加盖盖玻片.于 24 h、48 h 观察记录大型溞的活动抑制情况,试验结果取四组平均值.用概率单位统计法计算半抑制浓度 48 h-EC50值及其 95 % 置信限\\(中华人民共和国农业部,2013\\).
2. 2 藻类生长抑制试验
2. 2. 1 试验条件
本试验是在温度23 ±1 ℃、光照强度为5 000 ~6 000 lux,光暗比为 14∶ 10,pH 值 8. 0 ± 0. 1 的条件下进行.
2. 2. 2 试验操作
试验按等间距设置 5 个试验组和一个空白对照组进行,试验配制 0. 2、0. 3、0. 45、0. 68、1. 0 mg/L 的浓度系列,得到受试物试验溶液.分别取各浓度系列 100 ml 于 300 ml 三角瓶中,加入羊角月牙藻藻种,使藻种的细胞浓度为 1 ×10^4cells / ml,混匀.每个系列设置 3 个平行,同时设置空白对照组.将装好的受试物试验液的三角瓶放置于人工气候培养箱中培养,于 24 h、48 h、72 h 时观察并记录藻在试验溶液中的生长情况.采用概率单位法计算受试物对羊角月牙藻的半数生长抑制率 72 h-EC50值及其 95 %置信限.
试验周期内平均生长率计算方法如下:
上式中:
μi-j表示从时间 i 到时间 j 的平均生长率;
Xi表示在时间 i 的藻细胞浓度;
Xj表示在时间 j 的藻细胞浓度;
将受试物浓度对数与平均生长率进行线性回归,求得 EC50值.
2. 3 蚯蚓急性毒性试验
2. 3. 1 试验条件
本试验是在温度 20 ± 1 ℃、光照强度为 500 ~600 lux,连续光照.
2. 3. 2 试验操作
试验选择 0、0. 1、1、10 mg ai/kg- 1干土3 个浓度组进行试验,不设平行组,并同时进行空白对照组试验.试验选取驯养合格的蚯蚓随机分至各组,每个容器中放入 10 条,试验周期为 10 d.结果表明:在14 d 试验中,在所有受试物试验浓度中,蚯蚓均未发生死亡\\(中华人民共和国农业部,2013\\).
3 结果及分析
3. 1 咯菌腈对大型溞的毒性
在大型溞急性毒性试验中,试验于 24 h、48 h观察记录溞受抑制情况,结果如表 1 所示.将溞抑制率换算成概率单位后与咯菌腈浓度对数进行线性拟合,如图 1 所示.根据线性方程采用概率单位法计算咯菌腈对大型溞的半抑制浓度 48 h-EC50值为 0. 55 mg/L,其95 %置信限为 0. 45 ~0. 77 mg/L,参照农药溞类活动抑制试验毒性分级标准,咯菌腈对溞的毒性为高毒.
3. 2 咯菌腈对羊角月牙藻的生长抑制毒性试验分别于 0 h、24 h、48 h、72 h 用藻类计数仪对藻细胞进行计数,记录不同浓度藻的生长量,结果取三组平行的平均值,结果见表 2.将试验结果采用直线内插法进行统计分析,将咯菌腈试验溶液浓度对数与 72 h 时对羊角月牙藻的生长抑制率进行线性拟合,绘制咯菌腈对羊角月牙藻的浓度-剂量效应曲线图,结果如图 2 所示.根据线性方程计算在 72 h 时咯菌腈对羊角月牙藻的半抑制浓度 72 h-EC50为 0. 66 mg/L,其 95 % 置信限为 0. 62 ~ 0. 74mg / L.参照农药藻类生长抑制试验毒性分级标准,咯菌腈对羊角月牙藻的毒性级别为中毒\\(中华人民共和国农业部,2013\\).
3. 3 咯菌腈对蚯蚓赤子爱胜的毒性
试验于 14 d 试验结束时观察记录蚯蚓赤子爱胜的死亡情况,试验结果见表 3.根据试验结果可知,咯菌腈对蚯蚓赤子爱胜的半致死浓度 LC50>10 mg ai / kg- 1干土.参照农药蚯蚓急性毒性试验分级标准,咯菌腈对蚯蚓的毒性级别为低毒\\(中华人民共和国农业部,2013\\).
4 结论
本文通过研究咯菌腈对大型溞、羊角月牙藻和蚯蚓的毒性,直接反映了咯菌腈对不同生物体毒性的大小,为咯菌腈在环境施用的风险评估提供了依据.在本试验条件下,3 种不同的受试生物对咯菌腈表现出了不同的毒性,其在环境中的行为及生态效应表现出不同的毒性效应可能因生物或环境不一致导致不同生物的敏感性不同,在该试验中,水生生物溞、藻均表现出较高的敏感性,对咯菌腈均表现出了一定的毒性,其施用将会对水环境造成一定的污染,在农业生产及施用过程中应谨慎,尽量避免对人和周围环境造成危害.其对陆生生物蚯蚓表现出了较低毒性,可能是蚯蚓对咯菌腈本身不敏感,若要对咯菌腈毒性进行全面正确的评价,需进一步进行其它生物体急性及慢性毒性试验研究,以综合评价其对整个生态环境的潜在风险.
参考文献:
中华人民共和国农业部,2013. 化学农药环境安全评价试验准则-溞类急性活动抑制试验[S]. 中国标准出版社 .
中华人民共和国农业部,2013. 化学农药环境安全评价试验准则-藻类生长抑制试验[S]. 中国标准出版社 .
中华人民共和国农业部,2013. 化学农药环境安全评价试验准则-蚯蚓急性毒性试验[S]. 中国标准出版社 .
杨玉柱,焦必宁,2007. 新型杀菌剂咯菌腈研究进展[J]. 现代农药,5\\(6\\):35-39.
张晓光,王列平,钱一石,等 . 2013. 咯菌腈原药的高效液相色谱分析[J]. 农药,52\\(6\\):427-428.
