成纤维细胞作为动脉外膜最主要的细胞成分，在环境因素发生改变时具有调整其表型的能力。在血管内皮损伤的模型中，外膜表现出了显著增厚，其主要就是由于外膜成纤维细胞转化成肌成纤维细胞聚集引起的。但是关于动脉粥样硬化早期血管外膜成纤维细胞表型转化的报道甚少，本研究将通过整体动物及体外实验观察载脂蛋白E基因敲除\\(ApoE－/－\\)小鼠血管外膜成纤维细胞表型的变化，探讨血管外膜成纤维细胞表型转变在早期动脉粥样硬化病灶形成中的作用。

1、材料与方法

1.1主要材料

6周龄ApoE－/－小鼠和C57BL/6鼠购于北京大学医学部。DMEM培养基、胎牛血清购于美国Gibicol公司。兔多克隆抗体转化生长因子β1\\(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1\\)购于美国SantaCruz公司;抗小鼠波形蛋白\\(vimentin\\)抗体、抗小鼠结蛋白\\(desmin\\)抗体及抗小鼠α平滑肌肌动蛋白\\(α-smoothmuscleactin，α-SM-actin\\)抗体购于美国NeoMarkers公司;鼠组织免疫组织化学试剂盒购于福州迈新试剂公司;兔即用型SP免疫组织化学试剂盒购于北京中杉金桥生物技术公司;链霉亲和素-生物素-异硫氰酸酯\\(streptavidin-biotincomplex-fluoresceineisothiocya-nate，SABC-FITC\\)及链霉亲和素-生物素-cy3\\(streptavidin-biotincomplex-cy3，SABC-cy3\\)试剂盒购于武汉博士德公司。DAPI购于美国Sigma公司。

1.2标本制备

6周龄ApoE－/－小鼠和野生型C57BL/6小鼠，分别给予高脂饲料\\(基础饲料84.75%，饱和脂肪15%，胆固醇0.25%\\)喂养2周、4周和8周。在各个时间点处死动物后取升主动脉用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋制备连续切片。

1.3免疫组织化学染色

选取部分切片进行免疫组织化学染色检测α-SM-actin和Vimentin的表达，按鼠组织免疫组织化学试剂盒说明书操作。按兔即用型SP免疫组织化学试剂盒说明检测Desmin的表达。部分切片进行免疫荧光染色检测TGF-β1的表达，按SABC-cy3试剂盒说明书操作，显微镜下观察采集图像。

1.4血管外膜成纤维细胞的培养

6周龄野生型C57BL/6小鼠和ApoE－/－小鼠，高脂喂养2周后，颈椎脱臼处死，无菌开胸取出整条主动脉，仔细清除血细胞及血管周围脂肪组织，解剖显微镜下小心剥离外膜。用眼科剪将组织剪碎成约1mm3小块，接种到培养瓶中，加入含15%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%CO2干涸培养2～4h待组织块贴牢后轻轻翻转培养瓶继续静置培养，观察大部分组织块周围爬出细胞，融合成片时，用0.25%胰蛋白酶消化并采用差速贴壁法纯化两次。

选取第3～5代细胞，进行后续实验。

1.5免疫荧光染色检测体外培养成纤维细胞中Vi-mentin、α-SM-actin和Desmin的表达

取对数生长期细胞，0.25%的胰酶将细胞消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×108cells/L，接种于带爬片的6孔板中，静置培养48h待细胞长至亚融合状态后，血清饥饿24h，然后更换含有10%胎牛血清的DMEM，继续培养24h，弃去培养液，取出细胞爬片。PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛固定20min。然后PBS冲洗3遍，3%过氧化氢室温孵育15min，以消除内源性过氧化物酶。之后Vimentin免疫荧光染色按SABC-FITC试剂盒进行，α-SM-actin及Desmin免疫荧光染色按SABC-cy3试剂盒进行。

1.6透射电镜观察细胞超微结构

取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化细胞成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×109cells/L，接种于新培养瓶中，后静置培养48h待细胞长至亚融合状态，血清饥饿24h，更换含10%胎牛血清的DMEM，继续培养24h，然后收集细胞［约\\(15～20\\)×106个培养细胞］，经过固定、漂洗、脱水、渗透包埋与聚合、切片、染色后透射电镜下观察细胞超微结构。

1.7WesternBlot检测α-SM-actin及TGF-β1蛋白的表达

收集细胞加入100μL细胞裂解液，冰上孵育20min，10000×g离心5min，取各组细胞的裂解液10μL，各加入5μL上样缓冲液，混匀。水中煮沸3～5min，10000×g离心1min，冰上放置，上样。经电泳、考马斯亮兰染色、脱色，转膜，封闭后加入一抗α-SM-actin或TGF-β1，4℃杂交过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育1h，洗膜，化学发光法显色。结果作半定量分析。

1.8统计学分析

检测结果均用x±s表示，采用软件SPSS11.5进行分析，两组间比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有显著性。

2、结果

2.1免疫组织化学染色检测血管外膜α-SM-actin的表达

各个时间点的ApoE－/－小鼠血管外膜大部分细胞呈现Vimentin阳性表达，Desmin始终呈阴性，而中膜细胞对Vimentin、Desmin、α-SM-actin三种单抗均呈阳性反应。高脂喂养2周的ApoE－/－小鼠血管外膜部分细胞检测到α-SM-actin阳性表达，此时并无可见内膜病灶形成，高脂喂养4周后内膜出现泡沫细胞，血管外膜α-SM-actin阳性表达增多，但8周后外膜α-SM-actin呈弱阳性表达，此时内膜动脉粥样硬化病灶进一步发展，内膜α-SM-actin表达呈阳性。而C57BL/6小鼠血管外膜细胞只检测到Vimentin阳性表达，始终未检测到α-SM-actin阳性表达\\(图1\\)。

2.2免疫荧光染色检测TGF-β1表达

6周龄ApoE－/－小鼠\\(高脂喂养前\\)和各个时间点的C57BL/6小鼠主动脉外膜细胞均无TGF-β1的表达，高脂喂养2周后，ApoE－/－小鼠主动脉外膜细胞呈现TGF-β1弱阳性表达。高脂喂养4周后，主动脉外膜细胞TGF-β1表达增强，此时内膜损伤处呈现TGF-β1弱表达，高脂喂养8周后主动脉外膜和内膜损伤处呈现TGF-β1强阳性表达\\(图2\\)。

2.3免疫荧光染色检测体外培养成纤维细胞Vim-entin、α-SM-actin和Desmin

ApoE－/－小鼠血管外膜成纤维细胞除了Vimen-tin染色阳性外，还有部分细胞表现为α-SM-actin染色阳性，但Desmin染色一直呈阴性。C57BL/6小鼠血管外膜成纤维细胞仅表现为Vimentin染色阳性，而Desmin和α-SM-actin均呈阴性反应\\(图3\\)。

2.4透射电镜观察细胞超微结构

C57BL/6小鼠血管外膜细胞主要表现出典型成纤维细胞的特征，细胞呈梭形或者不规则形，有多个较长的胞质突起，核为卵圆形，偶见微管微丝。而ApoE－/－小鼠血管外膜细胞有部分细胞的超微结构发生改变，可见肌丝明显增多，呈现出肌成纤维细胞的特征\\(图4\\)。

2.5α-SM-actin及TGF-β1蛋白的表达

ApoE－/－小鼠成纤维细胞α-SM-actin\\(5.102±0.896\\)及TGF-β1\\(7.573±1.043\\)蛋白表达水平都明显高于C57BL/6小鼠\\(0.126±0.521和0.279±0.769\\)，差异有显著性\\(P＜0.05;图5\\)。【图１５】

3、讨论

血管外膜长期以来被认为只是充当内皮损伤始动动脉粥样硬化病灶形成的“配角”，随着研究的深入，越来越多的证据显示外膜可以通过由外而内的作用影响血管中膜及内膜。外膜是多种血管活性因子的主要来源，是血管重塑过程中的重要参与者。

血管外膜发生的变化\\(如结缔组织生成增多、炎症反应以及细胞改变等\\)可能是即将发生的血管疾病的信号。在对损伤的反应过程中，外膜细胞可表现出不同的结构和功能行为，有报道在中度和重度球囊损伤实验模型中外膜的成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞。动脉损伤后早期血管外膜成纤维细胞逐渐转化为肌成纤维细胞。成纤维细胞的表型转化和增殖活性改变参与并促进了血管桥再狭窄的发生过程。在移植性血管病模型中发现新生内膜增生之前外膜即出现大量a-SM-actin阳性的肌成纤维细胞。但是关于动脉粥样硬化早期血管外膜成纤维细胞表型转化的报道甚少。本实验观察了ApoE－/－小鼠动脉粥样硬化病灶形成过程中血管外膜成纤维细胞表型的变化。结果发现高脂喂养2周和4周后的ApoE－/－小鼠血管外膜细胞发生了表型改变，其在逐渐获得α-SM-actin表达的同时，Desmin染色持续阴性，Vimentin则持续呈阳性表达。Vimentin为间质细胞标记物，Desmin则是高分化平滑肌细胞的标记物，结果显示所测细胞为成纤维细胞，并表现出向肌成纤维细胞转化的特征。体外培养成纤维细胞结果也证实ApoE－/－小鼠血管外膜部分细胞的超微结构发生改变，可见肌丝明显增多，呈现出肌成纤维细胞的特征。免疫荧光染色除Vimentin染色阳性外，还有部分细胞表现为α-SM-actin染色呈阳性，但Desmin染色一直呈阴性，结果说明ApoE－/－小鼠血管外膜细胞仍保持了成纤维细胞的表型特点，但有部分转化为肌成纤维细胞，而非典型平滑肌细胞。肌成纤维细胞是一种具有平滑肌细胞样特点的成纤维细胞。它也能分泌细胞外基质和多种生物活性因子参与组织修复，一旦创伤愈合，肌成纤维细胞迅速回转到成纤维细胞或进入凋亡。

本研究结果显示高脂喂养8周后的ApoE－/－小鼠血管外膜呈现α-SM-actin弱阳性表达，这可能表示肌成纤维细胞向内膜迁移，或又转为成纤维细胞，或进入凋亡。

许多生长因子，如血小板源生长因子\\(PDGF\\)、TGF-β、肿瘤坏死因子α\\(TNF-α\\)和碱性成纤维细胞生长因子\\(bFGF\\)等都参与了成纤维细胞表型转化的过程。其中TGF-β1参与了多种细胞的增殖及分化，其可诱导大鼠腹膜间皮细胞转化。大鼠肺动脉高压的肺组织中TGF-β1表达水平也显著增高。TGF-β1是目前公认的能直接诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞进行表型转化的诱导因子。

我们在实验中也观察到ApoE－/－小鼠随着高脂喂养时间延长，主动脉外膜TGF-β1的表达增加，从而促使成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。体外实验结果也显示ApoE－/－小鼠血管外膜成纤维细胞中TGF-β1蛋白表达水平明显高于C57BL/6小鼠。成纤维细胞转化为肌成纤维细胞后又会分泌基质蛋白、细胞因子等，进行大量增殖，并且迁移到新生内膜中，可促进平滑肌细胞和内皮细胞的增殖。增多的细胞外基质又可进一步促进成纤维细胞增殖及表型转化来参与血管重塑。因此成纤维细胞转化为肌成纤维细胞后将有助于动脉粥样硬化病灶形成。

本研究结果提示动脉粥样硬化病灶形成早期血管外膜成纤维细胞即出现表型转变为肌成纤维细胞的特性，从而影响外膜和血管中膜及内膜之间的交互对话，参与动脉粥样硬化病灶的形成及进展，这可能成为抑制不良血管重塑的干预靶点。

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