肠道病毒71型\\(EV71\\)属于小RNA病毒科,是引起儿童手足口病和中枢神经系统感染的主要病原之一[1]。在临床上致残率及病死率均较高。近年来,EV71的流行在亚太地区呈上升趋势[2]。EV71感染取决于病毒、宿主及环境的多重作用,但目前其发病机制及免疫学特点尚未明确,因此,从宿主遗传易感因素出发探讨与病毒感染的相关性越来越受到重视[3]。人2′-5′寡聚腺苷酸合成酶\\(OAS\\)是一类由干扰素\\(IFN\\)诱导产生的酶蛋白,主要由OAS-1、OAS-2和OAS-3基因编码,能够激活潜在性RNA酶\\(RNase L\\),从而降解病毒mRNA、抑制病毒蛋白合成和促进病毒感染细胞发生凋亡,构成了清除病毒的第一道关卡[4-5]。鉴于OAS在抑制病毒复制过程中发挥的作用,本实验采用序列特异性引物-聚合酶链反应\\(PCR-SSP\\)技术,分别检测EV71感染病儿OAS1外显子-6区rs-1131476\\(G/A\\)位点、OAS2内含子-2区rs1293767\\(G/C\\)位点及OAS3的5′端rs7132797\\(C/A\\)位点单核苷酸多态性\\(SNP\\),探讨其与EV71易感性及感染后严重程度的关系,从而进一步了解EV71的遗传易感因素。
1对象与方法
1.1研究对象
2011年11月—2012年12月,收集我院及青岛市妇女儿童医院EV71感染手足口病病儿163例,男107例,女56例;年龄1.3~6.7岁。其中重症72例,均为年龄3.5岁以下,占总数的44.1%。根据卫生部《手足口病诊疗指南\\(2010年版\\)》,将163例病儿分为轻症组\\(91例,为轻症手足口病\\)和重症组\\(72例,均合并不同程度中枢神经系统损害表现\\)。另收集同期同地区健康体检儿童103例作为对照组,男62例,女41例,年龄1.2~9.7岁。对照组儿童无临床感染症状,血常规及生化指标检查均在正常范围内。
1.2研究方法
1.2.1标本采集采集手足口病病儿急性期\\(病程前3d内\\)粪便标本和静脉EDTA抗凝血3mL,对合并中枢系统感染者同时采集脑脊液,且经RT-PCR检测粪便及脑脊液EV71病毒核酸均为阳性。
1.2.2标本基因组DNA制备采用天根公司全血DNA提取试剂盒,按试剂盒操作说明提取ED-TA抗凝血人基因组DNA,按照入选病儿的统一编号标注后,置于-20℃保存备用。
1.2.3 Hardy-Weinberg平衡定律检测根 据Hardy-Weinberg平衡定律,分别对EV71感染组与对照组OAS1基因外显子-6区rs1131476\\(G/A\\)位点、OAS2内 含 子-2区rs1293767\\(G/C\\)位 点 及OAS3的5′端rs7132797\\(C/A\\)位点各等位基因的检测数和预期数进行检验,P均>0.05,提示两组人群均符合Hardy-Weinberg遗传平衡。
1.2.4 OAS1、OAS2及OAS3基因SNP的PCR检测扩增各基因位点特异性引物\\(序列见表1\\),由上海天昊遗传分析中心合成。
PCR扩增条件:反应体积为7.5μL,其中含20ng模板DNA,0.2mmol/L的dNTPs,0.5μmol/L上、下游引物,0.5U Taq-DNA聚合酶,和10×PCR缓冲液1μL。反应条件:95℃预变性2min;随之94℃变性20s、60℃退火30s、72 ℃延伸90s,重复35个循环;最后72℃末延伸2min。反应完成后对扩增产物进行判读,剩余产物置于-20℃保存。
1.3数据分析
应用SPSS 17.0软件进行分析,基因型和等位基因频数分布比较采用卡方检验,以P<0.05为差异有显著性。
2、结果
感染组与对照组、轻症与重症组OAS2内含子-2区rs1293767\\(G/C\\)位点基因型GC+CC频数分布分别为37、25、22、15例,GG频数分布分别为126、78、69、57例,组间比较差异无显著意义\\(P>0.05\\);等位基因C频数分布分别为38、27、22、16,G频数分布分别为288、179、160、128,组间的差异无显著性\\(P>0.05\\)。感染组、对照组、轻症组与重症组OAS3的5′端rs7132797\\(C/A\\)位点AA、CA、CC基因型分布分别为13、61、89例,9、46、48例,10、36、45例,3、25、44例,组间比较差异无显著意义\\(P>0.05\\);等位基因A、C频数分别为87、239,64、142,56、126,31、113,组间比较差异无显著性\\(P>0.05\\)。而OAS1外显子-6区rs1131476\\(G→A\\)位点,如表2、3所示,163例EV71感染病儿与103例正常对照儿童均存在OAS1基因多态性,基因型分布以GA、AA最为常见,等位基因以A型多见。重症病儿OAS1位点A等位基因频率明显高于轻症病儿\\(χ2=7.002,P<0.05\\);轻、重症组间AA基因型分布频率比较差异有显著意义\\(χ2=6.389,P<0.05\\);而感染组与正常对照组相比,差异均无显著性\\(P>0.05\\)。
3、讨论
EV71属于小RNA病毒科,是引起儿童手足口病及中枢神经系统感染的主要病原之一。
EV71感染病儿病情大多较轻,病程呈自限性,重者可出现脑干脑炎、神经源性肺水肿或心肺衰竭。EV71感染发病机制尚未清楚,但宿主基因组与EV71易感性 的关系越来越受到重视,从微观水平探讨EV71感染的遗传易感机制是目前研究的主要方向之一。
本研究通过检测163例EV71感染病儿与103例正常对照儿童OAS1、2、3基因多态性,发现OAS2内含子-2区rs1293767\\(G/C\\)位点和OAS3的5′端rs7132797\\(C/A\\)位点各基因型及等位基因的频数分布在EV71感染组与对照组、轻症与重症组间差异无显著性。
OAS1外显子-6区rs1131476\\(G→A\\)位点AA基因型频率在轻、重症间差异有显著性,且重症病儿A等位基因频率明显高于轻症病儿,而感染组与对照组相比,差异均无显著性。提示携带A等位基因可能不会增加EV71的患病风险,但感染后会增加进展为重症的可能性。
OAS是一种干扰素诱导产生的抗病毒蛋白,同时也是细胞对细胞内应激和环境应激发生反应的信号通路中的一种重要信号激酶。在人体细胞中OAS主要有3种形式,OAS1、OAS2、OAS3。3种基因均位于12q24,其结构上的相似以及位置上的毗邻提示其具有共同调节细胞生长、分化、凋亡及抗病毒等功能。细胞受到EV71侵染后,诱导产生的OAS与病毒复制过程中产生的dsRNA结合并发生自身磷酸化后被激活,进而催化由ATP合成2′-5′寡聚腺苷酸\\(2′-5′A\\),2′-5′A再激活细胞内的RNaseL,从而降解病毒和细胞内的RNAs。同时,OAS也可以增强IFN的抗病毒作用。我们的全基因测序结果显示,OAS1外显子-6区rs1131476\\(G/A\\)位点鸟嘌呤\\(G\\)-腺嘌呤\\(A\\)的颠换,可导致密码子变化\\(GCA-ACA\\),使苏氨酸转变为脯氨酸,但目前有关氨基酸改变对OAS1结构及功能的影响知之甚少。为明确OAS1外显子-6区rs1131476\\(G/A\\)位点基因多态性与EV71感染易感性及感染的严重程度的具体机制,在继续增加样本量同时,仍需从OAS1蛋白的结构和功能改变方面做进一步的研究。
参考文献：
[1] 陈宗波,范希文,董永绥,等.山东地区肠道病毒中枢神经系统感染187例分析[J].中华儿科杂志,2003,41\\(3\\):199-202.
[2]KOMATSU H,SHIMIZU Y,TAKEUCHI Y,et al.Out-break of severe neurologic involvement associated with Entero-virus 71infection[J].Pediatr Neurol,1999,20\\(1\\):17-23.
[3] 赵娜,陈宗波,钱娜,等.IFN-γ+874位点单核苷酸多态性和蛋白表达水平与肠道病毒71感染关系[J].齐鲁医学杂志,2010,25\\(4\\):315-317,3.
